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Apr 24, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9226 (2023) Citar este artículo

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La ruptura de la integridad de la barrera hematorretiniana sustenta los cambios patológicos en numerosas enfermedades oculares, incluida la degeneración macular relacionada con la edad neovascular (nAMD) y el edema macular diabético (DME). Si bien las terapias anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) han revolucionado el tratamiento de enfermedades, todavía se requieren nuevas terapias para satisfacer las necesidades no satisfechas de los pacientes. Para ayudar a desarrollar nuevos tratamientos, se necesitan métodos sólidos para medir los cambios en la permeabilidad vascular en los tejidos oculares en modelos animales. Presentamos aquí un método para detectar la permeabilidad vascular mediante fluorofotometría, que permite mediciones en tiempo real de la acumulación de tinte fluorescente en diferentes compartimentos del ojo del ratón. Aplicamos este método en varios modelos de ratones con diferentes fugas vasculares aumentadas, incluidos modelos de uveítis, retinopatía diabética y neovascularización coroidea (CNV). Además, en el modelo de ratón JR5558 de CNV, observamos con el postratamiento anti-VEGF una reducción longitudinal de la permeabilidad, en los mismos ojos del animal. Concluimos que la fluorofotometría es un método útil para medir la permeabilidad vascular en el ojo del ratón y se puede utilizar en varios puntos de tiempo, sin necesidad de sacrificar al animal. Este método tiene el potencial de usarse tanto en la investigación básica para estudiar la progresión y los factores subyacentes de la enfermedad, como para el descubrimiento de fármacos y el desarrollo de nuevas terapias.

La pérdida de la integridad de la barrera sanguínea que conduce al edema y al posterior daño tisular se ha descrito como un factor contribuyente en una amplia variedad de enfermedades, incluidas la sepsis1, el cáncer2 y el accidente cerebrovascular3. En el ojo, la inestabilidad vascular y la acumulación de líquido dentro de la retina y los tejidos circundantes es una característica central de algunas de las enfermedades más comunes que amenazan la vista, como la degeneración macular relacionada con la edad neovascular (nAMD) y el edema macular diabético (DME), que, si no se trata, puede conducir a una pérdida rápida de la visión4,5,6,7. Además, las enfermedades oculares como el glaucoma8 y la uveítis9 también se han relacionado con una mayor permeabilidad vascular, aunque es posible que se requiera más investigación para definir este vínculo con la etiología de la enfermedad.

Los inhibidores anti-VEGF inyectados por vía intravítrea, como ranibizumab y aflibercept, se han convertido en un estándar de atención para el tratamiento de la nAMD y DME10,11, y han revolucionado los resultados visuales de los pacientes, aunque estas enfermedades continúan siendo las principales causas de discapacidad visual12, ya que no todos los pacientes responden. al tratamiento anti-VEGF, y algunos pacientes pueden continuar experimentando pérdida de líquido retiniano o subretiniano, o desarrollar fibrosis y atrofia a pesar del tratamiento. Para ayudar a abordar una de estas necesidades insatisfechas, la próxima generación de tratamientos ha entrado recientemente en el mercado, con el objetivo de restaurar la estabilidad vascular en el ojo, como faricimab (VABYSMO; Genentech/F. Hoffmann-La Roche Ltd.), un crecimiento endotelial vascular factor (VEGF)-angiopoyetina (Ang)-2 anticuerpo biespecífico13,14,15.

El desarrollo de nuevos tratamientos que pueden prevenir la fuga vascular ocular patológica continúa, a medida que evoluciona nuestra comprensión de estas enfermedades. Para ayudar a desarrollar estas nuevas terapias, se requieren modelos preclínicos y métodos respectivos que permitan monitorear los cambios en la permeabilidad vascular a lo largo del tiempo. Los métodos de permeabilidad actuales incluyen el azul de Evan16,17, el isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano18 y las técnicas de perfusión de microesferas19, así como técnicas basadas en imágenes como la angiografía con fluoresceína20,21 y la tomografía de coherencia óptica (OCT) de fuga mejorada con contraste exógeno22. Si bien muchas de estas técnicas están bien establecidas, también pueden tener algunos desafíos e inconvenientes, que se analizan con mayor profundidad en otro lugar20. El método descrito aquí también se puede utilizar junto con las técnicas existentes.

La fluorofotometría es una herramienta versátil que se ha utilizado durante mucho tiempo en entornos de investigación ocular clínicos y no clínicos23,24. Los instrumentos fluorofotómetros se han diseñado para medir la concentración de fluoróforos dentro de los tejidos oculares25 y, por lo tanto, se pueden utilizar para determinar la difusión y eliminación del tinte de referencia, para proporcionar una indicación del estado fisiológico de la vasculatura ocular. Los instrumentos de fluorofotometría han estado disponibles para aplicaciones oculares como flujo acuoso, farmacocinética de fármacos, producción de película lagrimal y fuga vascular en humanos26, ratas27,28 y otras especies29,30, pero hasta hace relativamente poco31 no era posible en ratones, debido a las limitaciones del tamaño del ojo. En este artículo examinamos el uso de una nueva tecnología accesible para medir la permeabilidad en la retina, el vítreo y la cámara anterior. Intentamos validar la tecnología en modelos animales de enfermedades oculares, además de proporcionar un ejemplo de cómo podría usarse para medir la permeabilidad vítrea después del tratamiento anti-VEGF, para demostrar su potencial en el desarrollo de terapias. Estos hallazgos indican que la fluorofotometría puede utilizarse para monitorear y cuantificar los cambios en la fuga vascular en el ojo del ratón, que también podría usarse junto con otros métodos existentes.

El paso inicial para validar el uso del fluorofotómetro de ratón fue asignar las distancias axiales del escaneo correspondientes a la retina, el vítreo y la córnea/cámara anterior del ojo del ratón. Para detectar el vítreo, comenzamos inyectando 20 ng de fluoresceína directamente en el espacio vítreo central, seguido de mediciones inmediatas con el fluorofotómetro a través del vítreo central. Se observó un pico agudo entre 69 y 77 pasos axiales (Fig. 1a). Después de esto, administramos 20 ng de fluoresceína por vía tópica al mismo ojo del ratón para mostrar la posición de la córnea/cámara anterior. Se identificó un pico entre 111 y 116 pasos axiales para la córnea/cámara anterior además del pico vítreo (Fig. 1b). En un segundo ratón, la inyección intravítrea (IVT) de 10 ng de fluoresceína (Fig. 1c) resultó en un pico vítreo de aproximadamente la mitad del tamaño de la dosis de 20 ng (Fig. 1b), pero en la misma distancia axial. Esto demostró la reproducibilidad de la distancia axial independiente de la dosis de fluoresceína y un tamaño de pico dependiente de la dosis de la inyección IVT. Sin embargo, no pudimos separar las mediciones de la córnea y la cámara anterior debido a limitaciones de resolución espacial.

Diferenciación de los diferentes compartimentos del ojo en escaneos del fluorofotómetro de ratón. Exploraciones con fluorofotómetro realizadas en ojos de ratón C57Bl/6J, a continuación; (a) inyección intravítrea de 20 ng de fluoresceína, (b) inyección intravítrea de 20 ng de fluoresceína, seguida de 20 ng de fluoresceína aplicada tópicamente, (c) inyección intravítrea de 10 ng de fluoresceína, y (d) inyección intravítrea de 125 ng de FITC-dextrano de 70 kDa e inyección intravenosa de 2,5 mg de FITC-dextrano de 70 kDa (exploraciones realizadas en ratones separados y combinadas en el mismo gráfico). Se realizaron inyecciones intravítreas en el vítreo central. Las etiquetas de cada figura muestran la ubicación del vítreo (central), la cámara anterior y la retina de cada ojo de ratón. AC = cámara anterior; IVT = intravítreo.

Después de la identificación del vítreo y la córnea/cámara anterior, buscamos diferenciar los compartimentos vítreo y retiniano. Usando FITC-dextrano de 70 kDa, cuyo gran tamaño en comparación con la fluoresceína (peso molecular = 376 Da) evita que penetre la barrera hematorretiniana y se difunda desde la retina hacia el vítreo, inyectamos a un ratón por vía intravenosa (IV) con 2,5 mg de FITC- dextrano, y comparó los picos con otro ratón que recibió 125 ng de FITC-dextrano IVT. En el ratón infundido con IV, se detectó un pico a una distancia axial de 51–55, que corresponde a la acumulación de FITC-dextrano en la retina, mientras que en el ojo de ratón administrado con IVT, el pico vítreo se detectó a una distancia axial de 69–74. La superposición de ambos trazos muestra que es posible la separación de los compartimentos retinal y vítreo (Fig. 1d). Las longitudes de camino para la retina, el vítreo y la córnea/cámara anterior identificadas en la Fig. 1 sirvieron como referencia para futuras mediciones oculares.

Después de la identificación de los diferentes compartimentos oculares del ratón mediante fluorofotometría, nuestro próximo objetivo fue determinar la sensibilidad del instrumento fluorofotómetro para detectar cambios en los niveles de dosis de fluoresceína en el ojo. Decidimos usar fluoresceína administrada sistémicamente, ya que este ha sido el fluoróforo de elección para múltiples estudios previos31,32,33, con los que luego pudimos comparar. Elegimos inicialmente probar dos vías sistémicas para la inyección de fluoresceína, IV y subcutánea (SC). La dosificación IV tiene la ventaja de que permite la administración directa del colorante a la circulación, por lo que no introduce variables de adsorción adicionales. Sin embargo, en nuestras manos, la inyección precisa de pequeños volúmenes conduce a una mayor variabilidad, y es posible que se requieran más ratones para generar conjuntos de datos (Figura 1 complementaria). Por el contrario, la dosificación SC (Fig. 2) produjo cambios sólidos en la intensidad de la fluorescencia, con una baja variabilidad de medición ocular entre animales.

Cursos de dosis-respuesta y tiempo después de la administración subcutánea de fluoresceína a ratones hembra C57Bl/6J. (a) Escaneos representativos y (b) cuantificación de fluoresceína en la retina, el vítreo y la cámara anterior promediados después de 30 min, de ratones inyectados con 0,25, 0,50 y 1,0 mg de fluoresceína por vía subcutánea. Cursos de tiempo que muestran niveles de fluorescencia en (c) la retina y el vítreo, y (d) la cámara anterior de ratones C57Bl/6J, 5–60 min después de la inyección subcutánea de 1 mg de fluoresceína. N = 5–6 ratones para dosis-respuesta en (a y b), y N = 3 ratones para cursos de tiempo (c y d). R = retina; V = humor vítreo; AC = cámara anterior; SC = subcutáneo.

En un experimento inicial usamos dosis crecientes de 0,25, 0,5 y 1,0 mg de fluoresceína inyectada SC, y después de 30 min realizamos exploraciones del ojo. Observamos un aumento dependiente de la dosis de fluoresceína en cada compartimento, como se muestra en el perfil de escaneo promedio (Fig. 2a), que podría cuantificarse mediante mediciones del área bajo la curva (AUC) de las señales fluorescentes en la retina, el vítreo y la cámara anterior. (Figura 2b). De este experimento, seleccionamos la dosis de 1 mg para los experimentos de curso de tiempo que se muestran en la Fig. 2c, d, ya que esta dosis era óptima para la detección de fluorescencia en los diferentes compartimentos oculares del ratón.

Luego monitoreamos la acumulación de fluoresceína en los diferentes compartimentos oculares cada 5 minutos, hasta 60 minutos después de la inyección. En el vítreo (Fig. 2c) y cámara anterior (Fig. 2d), se detectó una elevación lineal de la fluoresceína. En la retina, los niveles de fluoresceína se saturaron alrededor de 20 minutos después de la inyección SC (Fig. 2c). Con la dosificación IV (Fig. 1 complementaria), se observaron tendencias similares en comparación con la dosificación SC en la cámara anterior y el vítreo, sin embargo, los niveles de fluoresceína en la retina alcanzaron su punto máximo a los 5 minutos después de la administración y se redujeron en el transcurso del experimento, presumiblemente debido a un mayor nivel sistémico. autorización.

Como resultado de estos experimentos, decidimos continuar con una dosis de 50 mg/kg de fluoresceína para todos los experimentos posteriores, como se muestra en las Figs. 3, 4 y 5. La dosis de 50 mg/kg se aproxima a una dosis total de fluoresceína de 1 mg utilizada para experimentos de evolución de tiempo anteriores para un ratón de alrededor de 20 g. El ajuste al peso corporal asegura niveles plasmáticos de fluoresceína más consistentes. Además, para los experimentos restantes, los niveles de fluoresceína en los diferentes compartimentos oculares se normalizaron a valores plasmáticos y se expresaron como tales.

Aplicación del fluorofotómetro de ratón en el modelo de uveítis inducida por endotoxinas. Se inyectó LPS (1 ng) o PBS por vía intravítrea en los ojos de ratones C57Bl/6J y, 24 h más tarde, se realizaron fluorofotometría, OCT y angiografía con fluoresceína de ratones inyectados con 50 mg/kg de fluoresceína por vía subcutánea. (a) Angiografía con fluoresceína representativa (paneles superiores) e imágenes OCT (paneles inferiores), de ojos de ratón tratados con PBS (izquierda) y LPS (derecha) 50 minutos después de la administración de fluoresceína. La flecha en la imagen OCT del ojo inyectado con LPS muestra la presencia de células inmunitarias infiltrantes en el vítreo. ( b – d ) Los cursos de tiempo que cuantifican los niveles de fluoresceína en ( b ) la retina, ( c ) el vítreo y ( d ) la cámara anterior mediante fluorofotometría no revelaron diferencias significativas en los niveles de fluoresceína en la retina y la cámara anterior entre PBS y LPS tratamiento. Sin embargo, en el vítreo, se observó un aumento significativo en los puntos de tiempo posteriores de 45 a 60 minutos después del tratamiento con LPS. Los datos que se muestran en (b–d) están corregidos a los niveles plasmáticos de fluoresceína. (e) Los niveles plasmáticos de fluoresceína no fueron significativamente diferentes entre los grupos de tratamiento con PBS y LPS. Barras de escala = 500 μm. N = 5–8 ojos por punto de tiempo. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, utilizando ANOVA de dos vías con medidas repetidas, seguido de comparaciones múltiples de Bonferroni. Los datos se dan como medias ± SEM. PBS = solución salina tamponada con fosfato; LPS = lipopolisacárido.

Cuantificación de la permeabilidad en el modelo de ratón diabético de estreptozotocina (STZ) mediante fluorofotometría. En este experimento se usaron ratones que habían sido inducidos a ser diabéticos con STZ 10 semanas antes, y se compararon con animales de control no diabéticos de la misma edad. (a) Los niveles de glucosa en sangre se elevaron significativamente en ratones diabéticos STZ, 10 semanas después de la inducción de diabetes, mientras que (b) el peso corporal no fue significativamente diferente del de los ratones de control no diabéticos. Los niveles de fluoresceína en (c) la retina, (d) el vítreo y (e) la cámara anterior aumentaron significativamente en ratones STZ en varios puntos de tiempo de 40 a 60 minutos después de la inyección de 50 mg/kg de fluoresceína subcutánea, en comparación con controles no diabéticos. Los datos que se muestran en (c-e) se corrigen a los niveles plasmáticos de fluoresceína. (f) Los niveles plasmáticos de fluoresceína no fueron significativamente diferentes entre los grupos de tratamiento de ratones de control diabéticos y no diabéticos STZ. N = 6–16 ojos por punto de tiempo. La glucosa en sangre y el peso corporal se evaluaron estadísticamente mediante ANOVA de dos vías con medidas repetidas, seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Fuga del compartimiento ocular evaluada estadísticamente mediante ANOVA de dos vías con medidas repetidas, seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. * P < 0,05, ** P < 0,01, **** P < 0,0001. Los datos se dan como medias ± SEM.

Cuantificación de la permeabilidad en el modelo de ratón de CNV espontánea JR5558 y respuesta al tratamiento anti-VEGF medida mediante fluorofotometría. ( a - c ) Se inyectaron subcutáneamente 50 mg / kg de fluoresceína a ratones JR5558 macho y hembra y C57Bl / 6J de control de la misma edad, y se midieron los cursos de tiempo de las proporciones de los niveles de fluoresceína corregidos al plasma en compartimentos oculares separados. Los ratones JR5558 habían aumentado significativamente los niveles de fluoresceína en (a) la retina y (b) el vítreo en comparación con los ratones C57Bl/6J. Los niveles de fluoresceína en (c) la cámara anterior y (d) el plasma no fueron significativamente diferentes. (e-g) Los ratones JR5558 recibieron dosis al inicio (día 0) y el día 3 por vía intraperitoneal con anticuerpos de control anti-VEGF o IgG, y la fuga de fluoresceína se cuantificó mediante fluorofotometría al inicio y el día 7. Los niveles de fluoresceína corregidos al plasma circulante fueron medido 45 min después de la administración subcutánea de fluoresceína. (e) El tratamiento anti-VEGF redujo significativamente la cantidad de fluoresceína en el humor vítreo a aproximadamente el 77 % del valor inicial (f), mientras que el control de IgG no tuvo un efecto significativo. ( g ) Imágenes representativas de angiografía con fluoresceína de ojos de ratones JR5558 al inicio (paneles de la izquierda para cada grupo de tratamiento) y después del tratamiento (paneles de la derecha para cada grupo de tratamiento) después del tratamiento con IgG o anti-VEGF. N = 3–6 ojos para cursos de tiempo, N = 12 ojos por grupo para tratamientos con IgG y anti-VEGF Barras de escala = 500 µm. Fuga del compartimiento ocular evaluada estadísticamente mediante ANOVA de dos vías con medidas repetidas, seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Las concentraciones de fluoresceína vítrea corregidas al inicio y después del tratamiento se evaluaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Newman Keul. Cambio porcentual desde el inicio evaluado estadísticamente mediante la prueba T no pareada. *P < 0,05, **P < 0,01. Los datos se dan como medias ± SEM.

Después de seleccionar la dosis y la vía de administración de la fluoresceína, comenzamos a probar la idoneidad del fluorofotómetro de ratón para detectar cambios en la permeabilidad vascular en modelos de enfermedades. El primero que investigamos fue la uveítis inducida por endotoxinas (EIU), un modelo de uveítis anterior. La endotoxina LPS se inyectó IVT, para inducir inflamación y ruptura de la barrera hematorretiniana, y luego se realizó angiografía fluoresceínica, OCT y fluorofotometría 24 h después (fig. 3). Tratamiento de ojos con fuga vascular inducida por LPS observada mediante angiografía de fondo de ojo con fluoresceína, con un aumento concomitante en la entrada de células inflamatorias, que podría observarse mediante imágenes de OCT (Fig. 3a). Paralelamente, llevamos a cabo fluorofotometría, y en los animales tratados con LPS parecía haber una absorción de fluoresceína más lenta entre 15 y 25 minutos en la retina en comparación con los ratones inyectados con PBS (Fig. 3b), sin embargo, esto no alcanzó importancia. Además, a los 30 min y más tarde no hubo diferencias significativas en los niveles de fluoresceína en comparación con el grupo de control de PBS, como también fue el caso de la cámara anterior (Fig. 3d). Por el contrario, en el compartimiento vítreo, observamos niveles más altos de fluoresceína en los ojos tratados con LPS, que alcanzaron significación después de 45 minutos y continuaron hasta los 60 minutos (P <0.05; Fig. 3c). Los niveles de plasma después de 60 minutos no fueron significativamente diferentes entre los grupos de LPS y PBS (Fig. 3e), por lo que las diferencias en los niveles vítreos de fluoresceína probablemente fueron independientes de los cambios en la exposición sistémica.

Después de la validación del fluorofotómetro de ratón con EIU, pasamos al modelo de diabetes de ratón inducida por STZ para ver si se podían observar cambios en la fuga vascular relacionada con la hiperglucemia crónica. Después de la inducción de la diabetes, observamos por primera vez hiperglucemia a las 2 semanas en los ratones (datos no mostrados) que permaneció elevada hasta al menos 10 semanas después de la inyección de STZ (Fig. 4a). Los animales continuaron aumentando de peso tanto en el control no diabético como en los ratones diabéticos con STZ, sin embargo, a un ritmo más lento en el grupo STZ, que no alcanzó significación (Fig. 4b).

Dado que la fluorofotometría reveló niveles de detección bajos en las fases iniciales de las mediciones después de la inyección de fluoresceína, los niveles de detección fueron menos consistentes y confiables. Por lo tanto, eliminamos los puntos de tiempo tempranos después de la inyección e incluimos solo mediciones de 40 a 60 min. Los niveles de fluoresceína en cada compartimento ocular fueron significativamente diferentes de los de los grupos de control no diabéticos. Tanto en la retina como en la cámara anterior (Figs. 4c y e), los niveles de fluoresceína aumentaron desde los 50 minutos en ratones diabéticos con STZ, en relación con los controles no diabéticos. En el vítreo, fue evidente una elevación significativa de la fluoresceína en todos los puntos de tiempo medidos (Fig. 4d). La fluoresceína plasmática se redujo en ratones STZ (Fig. 4f); sin embargo, los valores no alcanzaron significación.

En un experimento de validación final, utilizamos el modelo de ratón JR5558 de vascularización coroidea espontánea (CNV). El ratón JR5558 se ha utilizado anteriormente en estudios preclínicos para probar nuevas terapias34,35, por lo que queríamos utilizar este modelo para controlar las reducciones en la permeabilidad longitudinalmente en los mismos ojos de animales después de la neutralización de VEGF. Inicialmente, comparamos la acumulación de fluoresceína en los ratones de control JR5558 versus C57Bl/6J de la misma edad, para ver cómo la presencia de CNV afectaba la fuga. Utilizamos ratones que tenían 13 semanas para estos experimentos, que ya tenían lesiones muy bien establecidas. En la retina, la fluoresceína aumentó entre 45 y 55 min después de la administración subcutánea de ratones JR5558 (Fig. 5a), pero no fue significativamente diferente de C57BL/6J a los 60 min. En el vítreo, se observó una elevación significativa de la fluoresceína en puntos de tiempo de 45 a 60 min (Fig. 5b). Para la cámara anterior, no se observaron cambios significativos entre los ratones C57Bl/6J y JR5558 (Fig. 5c), y los niveles plasmáticos no difirieron entre las cepas de ratones (Fig. 5d).

Para examinar el efecto de la neutralización de VEGF en la fuga de CNV en los ratones JR5558, administramos control de IgG o anticuerpos anti-VEGF por vía intraperitoneal dos veces a ratones JR5558 de 8 semanas de edad. La acumulación de fluoresceína se midió en el vítreo solo porque los niveles de fluoresceína en la retina eran demasiado variables (debido a la presencia de lesiones neovasculares con fugas que crearon áreas punteadas de señal de fluoresceína muy alta) y la patología neovascular está ausente en la cámara anterior. Los niveles de fluoresceína vítrea no fueron significativamente diferentes en los grupos de IgG y anti-VEGF al inicio del estudio. Después del tratamiento, los niveles de fluoresceína en el vítreo no cambiaron en el grupo de IgG; sin embargo, en el grupo de anti-VEGF hubo una reducción significativa del 25 % desde el inicio (P < 0,05; Fig. 5e, g). Cuando calculamos el cambio porcentual de cada animal individual desde el inicio, se observaron efectos similares, con una reducción general del 19 % en el grupo anti-VEGF, frente a un aumento del 7 % en los grupos de control de IgG (Fig. 5f). En conjunto, estos datos muestran que el fluorofotómetro se puede utilizar en ratones para proporcionar evaluaciones longitudinales de cambios en la permeabilidad en respuesta al tratamiento.

Aquí demostramos un método para mediciones en tiempo real de los cambios en la permeabilidad vascular, in vivo, en el ojo del ratón. El método se aplicó a modelos de ratón con retinopatía diabética, uveítis y neovascularización coroidea, donde se observaron aumentos en la fuga vascular en comparación con los animales de control. En un experimento final, demostramos que es posible atenuar los niveles elevados de fluoresceína usando un tratamiento anti-VEGF, y mostramos que los cambios de permeabilidad antes y después del tratamiento se pueden medir en los mismos ojos del animal.

Como con cualquier método, el éxito puede estar determinado por el uso óptimo de la tecnología. Con el fluorofotómetro de ratón hay que tener en cuenta una serie de factores. Es esencial tener una alineación precisa de la cabeza óptica del fluorofotómetro con el centro del eje visual del ratón, para permitir un escaneo consistente de datos reproducibles. Como la máquina es un dispositivo óptico, basado en excitación focalizada y detección de emisión de luz, es importante tener un eje visual lo más libre de interferencias posible. Un problema inicial fue que bajo anestesia, incluso con lubricación regular, los ojos de los ratones son propensos a desarrollar cataratas36, lo que hace imposible el registro de los niveles de fluoresceína en los tejidos oculares posteriores. Encontramos que la solución fue aplicar lentes de contacto en el ojo del ratón después de la inducción de la anestesia, lo que evitó la formación de cataratas. Además, las lentes de contacto deben estar libres de residuos dejados por el fluido (por ejemplo, PBS) que se seca en la superficie de la lente. Esto se puede resolver enjuagando las lentes con agua ultrapura antes de usarlas.

También relacionado con mantener un eje visual claro, el método puede ser sensible al daño de los tejidos oculares, por ejemplo, por inyecciones intravítreas o por agentes que causan inflamación. Descubrimos que en nuestros experimentos con la administración intravítrea de LPS, necesitábamos titular la dosis de LPS y realizar inyecciones intravítreas con agujas romas de calibre 34 para minimizar la incidencia de hemorragia vítrea o células inflamatorias en la cámara anterior. Se observó variabilidad entre diferentes lotes de LPS, por lo que era importante utilizar números de lote idénticos siempre que fuera posible. La dilatación constante de los ojos también era imperativa; se añadieron agentes dilatadores después de la anestesia, con el mismo volumen de Tropicamida administrado a cada ojo.

En nuestros experimentos, probamos la fluoresceína como colorante, ya que se usa ampliamente en estudios de imágenes y permeabilidad, además de tener un perfil de seguridad favorable para el uso repetido en ratones. Otros tintes con diferentes pesos moleculares pueden ser mejores en los experimentos de fluorofotometría para detectar cambios dependientes de fugas, pero están más allá del alcance del manuscrito actual. Utilizamos principalmente la vía de administración subcutánea para la fluoresceína, ya que resultó ser la más sencilla de realizar, lo que provocó menos errores de dosificación y redujo la relación señal/ruido en comparación con la vía intravenosa. Otra variable crítica fue el momento de la dosificación de fluoresceína de los animales. Descubrimos que dosificar a los animales una vez que habían sido anestesiados disminuyó drásticamente la variabilidad de nuestros resultados, quizás porque los ratones bajo anestesia están estáticos y pueden tener tasas metabólicas similares.

La fluorofotometría de ratón tiene ventajas clave sobre algunas técnicas existentes para medir la permeabilidad, como el azul de Evan u otros métodos basados ​​en la perfusión. En primer lugar, no es necesario sacrificar al animal para realizar el ensayo, lo que significa que los animales pueden utilizarse potencialmente para múltiples experimentos. Esto ayudará a la práctica de las 3R (reducción, refinamiento y reemplazo) en la investigación con animales29. En segundo lugar, es posible controlar la fuga vascular en el mismo animal de forma longitudinal utilizando medidas repetidas, lo que permite a los investigadores calcular los efectos previos y posteriores al tratamiento, o el desarrollo de la permeabilidad a lo largo del tiempo en modelos de enfermedades oculares. En tercer lugar, el método también se puede utilizar en combinación con métodos más establecidos para la permeabilidad, como el azul de Evan, y junto con técnicas de imagen como la angiografía con fluoresceína. Además, dado que el dispositivo está adaptado para su uso en ratones, esto significa que es posible combinar mediciones de fugas con manipulación genética específica en la especie, para buscar factores que contribuyan a la ruptura de la barrera hematorretiniana. Sin embargo, una desventaja es que debido a las diferencias significativas en la anatomía y fisiología ocular y sistémica, los resultados en ratones deben tomarse con precaución si se intenta comparar directamente los valores absolutos de fuga entre las especies, incluso en estudios con humanos.

En resumen, recomendaríamos que el fluorofotómetro de ratón se pueda utilizar en experimentos en los que se pueda mantener un eje visual claro. Los tratamientos o alteraciones genéticas que conducen, por ejemplo, a cataratas, hipema o hemorragia vítrea pueden ser mejor atendidos por métodos como el Azul de Evan u otros métodos basados ​​en perfusión. Sin embargo, si el eje visual puede permanecer claro, entonces la fluorofotometría de ratón se puede usar en múltiples puntos de tiempo junto con los métodos existentes y se puede usar junto con métodos basados ​​en imágenes como la angiografía con fluoresceína, donde una imagen ocular puede ser informativa. Además, si el investigador desea comparar sus datos con métodos basados ​​en perfusión, aún puede hacerlo, si es necesario.

En conclusión, vemos al fluorofotómetro de ratón como una herramienta muy útil tanto para la investigación básica como para el descubrimiento de fármacos. A medida que surge la próxima generación de terapias para la degeneración macular húmeda relacionada con la edad y el edema macular diabético, está claro que contar con las mejores herramientas ayudará a identificar fármacos que interactúen con vías novedosas, brindando la combinación óptima de control de fluidos y durabilidad del efecto del tratamiento. . El fluorofotómetro de ratón puede ofrecer un método adicional para ayudar a separar los mejores tratamientos novedosos.

En la tabla 1 se muestra información sobre raza, edad, sexo y proveedor de los animales utilizados en los diferentes experimentos a lo largo del estudio.

Todos los animales recibieron alimento y agua ad libitum, en un ciclo día/noche de 12 h, ambiente con temperatura controlada. Los experimentos con animales fueron aprobados por la Oficina Federal de Seguridad Alimentaria y Veterinaria de Suiza (referencias BS-2730 y BS-2734) y se realizaron en estricto cumplimiento de la ordenanza federal suiza sobre protección y bienestar animal, así como de acuerdo con las reglas de la Asociación. para la investigación en la declaración de visión y oftalmología para el uso de animales en las pautas de investigación oftálmica y de la visión, y en cumplimiento de las pautas ARRIVE.

Para las inyecciones de lipopolisacárido (LPS) intravítreo (IVT), los animales se anestesiaron usando isoflurano al 3 %, O2 al 100 %. Para todos los demás experimentos, los ratones se anestesiaron usando la combinación subcutánea de medetomidina (Dorbene®, 0,5 mg/kg, Graeub AG, Berna, Suiza), midazolam (5 mg/kg, Roche Pharma AG, Grenzach- Whylen, Alemania) y fentanilo ( Curamed®, 0,05 mg/kg, Actavis Switzerland AG, Regensdorf, Suiza). Para los experimentos de recuperación, los ratones se antagonizaron con una combinación de buprenorfina (Bupaq®, 0,2 mg/kg, Streuli Pharma AG, Uznach, Suiza), atipemazol (Alzane®, 2,5 mg/kg, Graeub AG, Berna, Suiza) y flumazenil. (Anexate®, 0,5 mg/kg, Roche Pharma AG, Grenzach- Whylen, Alemania).

Antes de la aplicación IVT, se preparó una solución de LPS (Cat L6529; Sigma, St Gallen, Suiza) en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco estéril (DPBS; Life technologies, Suiza) a partir de alícuotas congeladas almacenadas a -20 °C con una concentración final de 1 ng/1 µl. Los animales fueron anestesiados con isoflurano y se aplicaron gotas de anestésico local (Novesin®; OmniVision, Suiza) y midriático (Tropicamide 0,5% SDU Faure, Théa Pharma SA, Schaffhausen, Suiza)). Los ojos se enjuagaron con povidona yodada al 5 % (iso-Betadine® al 5 %, MEDA-Pharma GmbH & Co.KG, Bad Hombourg, Alemania), seguido de PBS estéril, luego con una jeringa Nanofil y una aguja de calibre 34 conectada ( NF34BL-2) (ambos World Precision Instruments International, Friedberg, Alemania) Se inyectó 1 µl/ojo de LPS o PBS (control). Finalmente, los animales se colocaron de nuevo en la caja de alojamiento para su recuperación.

Después de 24 h, los ratones se anestesiaron con anestesia subcutánea, luego se tomaron imágenes de angiografía con fluoresceína (FA) y tomografía de coherencia ocular (OCT) de la retina y el vítreo para confirmar la presencia de células inflamatorias infiltrantes. Después de la obtención de imágenes, los ratones se sometieron a fluorofotometría.

Los animales se dividieron en dos grupos, recibiendo estreptozotocina (STZ; 50 mg/kg de peso corporal, 7,5 mg/ml, preparada en tampón de citrato de sodio 0,05 M, pH 4,5) o PBS inyectado por vía intraperitoneal (IP) durante cinco días consecutivos. STZ se preparó y almacenó en un refrigerador al menos 30 minutos antes de la administración. Cinco días después de las últimas dosis de STZ o PBS, se midió la glucosa en sangre a través de una punción en la vena de la cola usando un sistema de monitoreo de glucosa en sangre AlphaTrak (Abbott Laboratories Inc USA, Alameda, CA) y tiras reactivas (Alpha Trak2, Zoetis Schweiz, Zürich Suiza). El desarrollo de diabetes se definió como un grupo de niveles de glucosa en sangre superior a 14 mmol/L (250 mg/dl). Los animales con niveles de glucosa inferiores a 250 mg/dl no fueron reinyectados ni incluidos en el estudio. El peso y la glucosa del animal se monitorearon durante todo el estudio, y solo los ratones con niveles de glucosa en sangre continuamente elevados se consideraron diabéticos. Para las mediciones de fluorofotometría, los animales se midieron 10 semanas después de la STZ.

Se utilizaron ratones JR5558 machos y hembras33 a lo largo de los estudios. Para los estudios de evolución temporal y tratamiento farmacológico anti-VEGF, los animales tenían 13 y 8 semanas de edad, respectivamente. Para los experimentos de tratamiento farmacológico, los ratones se sometieron a una evaluación de angiografía con fluoresceína (FA)34 y fluorofotometría de referencia en la semana 8 el día anterior a la dosificación de anticuerpos, para asignar animales a grupos de tratamiento con números estadísticamente iguales (P > 0,05; prueba t no apareada) de lesiones y concentraciones de fluoresceína en diferentes compartimentos oculares. Se administraron IP anti-VEGF (B20-4.137) o anticuerpos de control IgG un día después de la línea base y luego una dosis repetida 3 días después (1 ml/100 g de peso corporal, 2 dosis en total). Los datos de FA y fluorofotometría se recopilaron nuevamente una semana después de la dosis inicial de anticuerpos, para comparar los efectos previos y posteriores al tratamiento del control anti-VEGF e IgG. Para la evaluación inicial y posterior al tratamiento de los ratones JR5558, se seleccionó el punto de tiempo de 45 minutos para la fluorofotometría.

Las mediciones de fluorofotometría se llevaron a cabo en un fluorofotómetro ocular de barrido (Fluorotron Master Research Mouse Edition; OcuMetrics, Inc., Mountain View, CA). Un protocolo más detallado que describe los métodos utilizados en este manuscrito se puede encontrar en la sección de métodos complementarios.

Para garantizar que las concentraciones de fluoresceína medidas en nuestros experimentos estuvieran en el rango lineal, ejecutamos una curva estándar de fluoresceína. Las curvas estándar no se utilizaron para el cálculo de los niveles de fluoresceína en experimentos posteriores, ya que el fluorofotómetro proporciona mediciones directas de fluoresceína en ng/ml. La curva estándar se realizó en microcubetas con PBS como diluyente, utilizando el portamicrocubetas suministrado por el fabricante. Utilizando esta curva estándar, se observó una relación lineal a medida que aumentaba la concentración de fluoresceína (R2 > 0,99; Fig. 6), lo que indica que los cambios en los niveles de fluoresceína observados en nuestros experimentos se debieron a diferencias dependientes de la concentración.

Curvas estándar de fluoresceína. Curvas estándar para fluoresceína en (A) PBS y (B) plasma. Los estándares de fluoresceína se prepararon en PBS o plasma de ratón, luego se diluyeron más en PBS, antes de medir la concentración de fluoresceína (ng/ml) en una microcubeta. Se llevó a cabo un análisis de regresión, con las estadísticas mostradas en los gráficos de la Figura.

Para los experimentos in vivo, los animales fueron anestesiados usando anestesia subcutánea. Después de la anestesia, los ojos se dilataron con tropicamida al 0,5 % (Tropicamide 0,5 % SDU Faure, Théa Pharma, Schaffhausen, Suiza), luego, 5 min más tarde, solución de fluoresceína (cat 46,960; Sigma-Aldrich, St Gallen, Suiza) o FITC-dextrano 70 kDa ( cat 46,945; Sigma-Aldrich, St Gallen, Suiza) se administró IV, IVT o SC, en las dosis descritas en las secciones de resultados. Para obtener resultados más consistentes, observamos que era mejor administrar fluoresceína después de la anestesia.

Después de la inyección de fluoresceína, se colocaron lentes de contacto planas de 3,2 mm (Cantor and Nissel, Northamptonshire, Reino Unido) en los ojos del ratón. Los lentes de contacto se usan para evitar que se sequen, lo que puede conducir a la formación de cataratas. Luego, los animales se colocaron en un escenario de temperatura controlada (37 ° C) y los ojos se alinearon paralelos al dispositivo óptico. Los escaneos oculares se registraron tanto en el ojo izquierdo como en el derecho utilizando una excitación de 450 a 490 nm y una detección de emisión de 520 a 600 nm, en los puntos de tiempo indicados en cada sección de resultados. Los escaneos oculares tomaron aproximadamente 20 s por escaneo.

En algunos casos, después de la fluorofotometría, se tomaron muestras de sangre (25 µl) de la vena de la cola para la preparación de plasma (Microvette CB 300K2E; Sarstedt AG, Alemania) para normalizar los escaneos a la fluoresceína circulante, para tener en cuenta las posibles diferencias de administración. Las muestras de sangre se centrifugaron a 10.000 × g durante 10 min, luego se diluyeron 10 µl del plasma resultante en 990 µl de PBS en una microcubeta protegida de la luz (PS Micro Photometer Cuvette 2 ml; LP Italiana, Milán, Italia) y se escanearon en el Máquina de fluorotrón que usa el portacubetas provisto, también usa excitación de 450–490 nm y detección de emisión de 520–600 nm.

Para cuantificar las mediciones de fluorofotometría, los datos sin procesar se exportaron como txt. archivos, luego trazado usando Microsoft Excel. El área promedio bajo la curva (AUC) se calculó para 5 pasos en cada una de las regiones de los escaneos correspondientes a los picos de la retina, el vítreo y la cámara anterior, según lo determinado por los experimentos del compartimento ocular (Fig. 1). Los datos no normalizados a la fluoresceína plasmática se expresan como ng/ml de fluoresceína ± SEM.

Para la normalización del plasma, se calculó la fluoresceína circulante promediando los valores pico máximos de escaneos duplicados. A continuación, se expresaron los niveles de fluoresceína en los compartimentos oculares como una relación con la fluoresceína plasmática, dividiendo los promedios brutos de AUC por los valores plasmáticos. Los datos se expresan como la relación media ± SEM del compartimento ocular:fluoresceína en plasma ng/ml.

Los datos sin procesar se exportaron desde el fluorofotómetro en archivos .txt y se copiaron en Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA). El procesamiento y el análisis se llevaron a cabo utilizando el software Excel y GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Para la comparación estadística de solo dos grupos, se empleó una prueba t no pareada. Se usó ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Newman Keul para comparaciones de 3 o más grupos. Para los datos de la evolución temporal, se utilizó el análisis de varianza ANOVA bidireccional (alfa 0,05) con medidas repetidas, seguido de pruebas de comparación múltiple (consulte las leyendas de las figuras para obtener más detalles). Los valores atípicos se eliminaron antes del análisis estadístico utilizando los criterios de Chauvenet, con valores atípicos definidos como ± 2 × desviaciones estándar de la media. Los datos se presentan como Media ± SEM con *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Los autores desean agradecer a Bruce Ishimoto, en primer lugar, por el amable préstamo inicial de una versión prototipo del dispositivo Fluorotron Master Mouse Edition, pero también por su asesoramiento y asistencia técnica. Este manuscrito está dedicado al profesor David Shima.

Descubrimiento de oftalmología, investigación farmacéutica y desarrollo temprano, Roche Innovation Center Basel, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basilea, Suiza

Nadine Colé, Janina Thoele, Christoph Ullmer y Richard H. Foxton

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NC: diseño de estudios, análisis de datos y estadísticas, trabajo in vivo, revisión y redacción de manuscritos; JT: diseño del estudio, trabajo in vivo, revisión y redacción del manuscrito; CU: revisión y redacción de manuscritos; RF: diseño de estudios, análisis de datos y estadísticas, trabajo in vivo, revisión y redacción de manuscritos. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Richard H. Foxton.

NC, JT, CU, RF eran todos empleados de F. Hoffmann-La Roche Ltd en el momento en que se realizaron estos experimentos.

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Reimpresiones y permisos

Colé, N., Thoele, J., Ullmer, C. et al. Mediciones en tiempo real de la permeabilidad vascular en el ojo del ratón usando fluorofotometría vítrea. Informe científico 13, 9226 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36202-4

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Recibido: 07 Diciembre 2022

Aceptado: 31 de mayo de 2023

Publicado: 07 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36202-4

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